北京专科手足癣医院 https://m-mip.39.net/czk/mipso_8833710.html心血管系统是仅次于肿瘤的circRNA的重要研究方向，今年6月顶级的心血管期刊《Circulation》又发表了一遍研究circRNA的文章——《LossofSuper-Enhancer-RegulatedcircRNANfixInducesCardiacRegenerationAfterMyocardialInfarctioninAdultMice》。这项研究表明circNfix的缺失通过抑制Ybx1泛素依赖性降解和增强Mir-活性促进心肌梗死（myocardialinfarction，MI）后心脏再生修复和功能恢复。
一背景原位激活心肌细胞增殖是在心肌梗死和心力衰竭等损伤或疾病后替换失去功能的心肌细胞的一种很有前景的方法。非编码RNA在细胞周期调节中起着至关重要的作用，将它们结合起来是促进心肌细胞增殖的有力策略。circRNA（环状RNA）是一类新的非编码RNA，其环状结构更稳定，增强了其与小RNA（microRNA）/蛋白质结合的能力。因此，circRNA可能比非环状RNA更有效地调节心脏基因调控网络及诱导心肌细胞增殖。已发现某些circRNA可控制细胞增殖、分化和发育，甚至组织再生。新出现的证据表明circRNA可能在心脏再生的调节中发挥重要作用。此外，circRNA参与心血管系统的生物过程和病理状态，包括心肌病的发展，心肌细胞肥大、衰老和、凋亡。二实验结果1
验证筛选的circRNA的表达
通过RNA测序和生物信息学分析发现了两个在成年和新生大鼠心脏中差异表达的超级增强子相关circRNA，其中，circNfix在成年大鼠心脏中的表达水平更高，circSlc8a1在新生大鼠心脏中的表达水平更高。与心脏成纤维细胞相比，circNfix在心肌细胞中富集，而circSlc8a1却相反。作者选择circNfix继续研究。RT-PCR、PCR产物测序、RNaseR或放线菌素D处理结合PCR实验证明circNfix确实能够被表达出来。定量PCR和RNA原位杂交实验表明circNfix在成年人、大鼠、小鼠的心脏中高表达，circNfix主要位于细胞浆中。2circNfix的功能：抑制心肌细胞增殖1、circNfix抑制7天龄小鼠心肌细胞增殖通过siRNA下调7天龄小鼠心肌细胞中circNfix的表达，细胞免疫荧光检测发现Ki67+心肌细胞、EdU+心肌细胞、pH3+心肌细胞、AuroraB+心肌细胞、Nkx2.5+心肌细胞、α-SMA+心肌细胞、RUNX1+心肌细胞和DAB2+心肌细胞的比例升高，更多细胞进行分裂和处于S和G2/M期。而在7天龄小鼠心肌细胞中过量表达circNfix导致Ki67+心肌细胞、EdU+心肌细胞和pH3+心肌细胞的比例降低。（Ki67、EdU、pH3和AuroraB基因是细胞周期活性标志，Nkx2.5、α-SMA、RUNX1和DAB2基因是去分化标志）2、circNfix的缺失促进成年小鼠心肌细胞增殖利用shRNA下调成年小鼠心脏中circNfix的表达，免疫荧光检测发现Ki67+心肌细胞、pH3+心肌细胞、AuroraB+心肌细胞和RUNX1+心肌细胞的比例增高，心肌细胞数量增加。利用shRNA下调心肌梗死的成年小鼠心脏中circNfix的表达，免疫荧光检测发现Ki67+心肌细胞、pH3+心肌细胞、AuroraB+心肌细胞的比例升高，TUNEL+心肌细胞的比例降低，IB4+细胞所占的区域增加。3、心肌梗死后circNfix的缺失促进心脏功能恢复与对照组相比，利用shRNA下调circNfix表达的心肌梗死成年小鼠的射血分数、缩短分数和心脏功能得到明显维持，梗死面积和心肌纤维减少，生存率显著增加。4、心肌梗死后circNfix抑制心肌细胞增殖和心脏功能恢复与对照组相比，circNfix过量表达的小鼠的Ki67+心肌细胞和pH3+心肌细胞的比例降低，心肌细胞减少。与对照组相比，circNfix过量表达的心肌梗死小鼠的Ki67+心肌细胞、pH3+心肌细胞、AuroraB+心肌细胞的比例降低，TUNEL+心肌细胞的比例升高，IB4+血管密度和α-SMA+血管密度降低，梗死面积和心肌纤维增加，射血分数和心脏功能降低。3
Meis1驱动circNfix表达
ChIP-seq、ChIP-PCR和EMSA表明Meis1能够直接结合Nfix位点的一个超级增强子。双萤光素酶实验表明Meis1能够激活该超级增强子下游基因的表达。利用siRNA下调Meis1表达，circNfix的表达水平降低，而NfixmRNA的表达水平升高，EdU+心机细胞的比例升高。利用siRNA同时下调Meis1和circNfix表达，EdU+心机细胞的比例没有明显变化。这些实验表明Meis1通过结合到Nfix位点的一个超级增强子上驱动circNfix表达。4circNfix抑制心肌细胞增殖的机制一：circNfx促进Ybx1降解RNApulldown和免疫共沉淀实验表明circNfix能够分别与Ybx1和Nedd4l（一种E3泛素连接酶）相互作用。circNfix过量表达显著降低心肌细胞Ybx1蛋白的表达水平，这种现象被蛋白酶体抑制剂MG减弱，但是circNfix过量表达不影响Ybx1mRNA的表达水平。此外，circNfix阻止Ybx1蛋白运输到细胞核。circNfix敲除和过量表达分别降低和增加心肌细胞Ybx1的泛素化。Nedd4l沉默提高Ybx1蛋白的稳定性，这可以消除circNfix过表达对Ybx1蛋白稳定性的影响。ChIP-PCR实验表明Ybx1能够结合cyclinA2和cyclinB1的启动子。这些实验结果表明circNfix通过结合Ybx1和Nedd4l介导Ybx1泛素化，进而诱导Ybx1降解。5
circNfix抑制心肌细胞增殖的机制二：circNfix结合miR-
生物信息学分析表明circNfix含有miR-的结合位点，降低circNfix的表达水平能够显著提高miR-的表达水平。双荧光素酶、RNApulldown和RNA荧光原位杂交实验证明circNfix能够结合miR-。RNA荧光原位杂交实验表明miR-和Gsk3β3′UTR共定位。miR-抑制Gsk3β表达，而circNfix和Meis1促进Gsk3β表达。已知GSK3β通过降解β-catenin来调节心肌细胞增殖。实验表明circNfix抑制β-catenin表达。此外Mir-抑制抵消了circNfix下调对心肌细胞增殖的影响，这种影响被GSK3β敲低逆转。这些实验结果表明circNfix可以通过circNfix—miR-—GSK3β—β-catenin通路调控心肌细胞增殖。三讨论circNfix既可以通过circNfix—Ybx1—cyclinA2/B1通路调控心肌细胞增殖，也可以通过circNfix—miR-—GSK3β—β-catenin通路调控心肌细胞增殖和血管生长。circNfix的缺失促进心肌再生修复与功能恢复，可能是一个有前途的改善心肌梗死后预后的策略。结语
其实circRNA的研究策略非常固定，如下所示：
高通测序或者基因芯片筛选差异circRNA?证明选择的circRNA确实能够被表达出来?目的circRNA的表达谱和亚细胞定位?Gainoffunction和lossoffunction研究目的circRNA的功能
?研究目的circRNA具有该功能的机制：miRNAsponge、结合蛋白或者表达蛋白
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LncRNA研究技术大盘点
生物信息学预测-lncRNA研究策略篇
你知道怎样验证RNA是circRNA还是lncRNA吗？
一篇19分的文章告诉你环状RNA应该怎么做！研究环状RNA发文章有多容易？
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