作者：姜浩东1，2，麦明杰2，赵明一3，陈瑞平1,2，吴楚漫4，朱平1,2
单位：1.华南理工大学医学院；2.广东省心血管病医院(广东省医学科学院)；3.医院；4.中国科学院广州生物医药与健康研究院
提要造血干细胞（hematopoieticstemcells,HSCs）获取相对容易、应用时无组织相容性问题及伦理争议，在再生医学的研究及应用中具有较大的潜力。研究证明造血干细胞具有促进心肌损伤后修复，改善受损心脏功能的作用。心肌梗死后多种细胞因子等生物活性分子及相关信号通路参与造血干细胞动员、归巢至心脏。同时，研究表明多种机制可能促进HSCs发挥心肌修复作用，如转分化、细胞融合、旁分泌、促进心外膜细胞发生上皮间充质转化等，但其确切机制尚有争议。本文就近年来关于HSCs在心肌梗死后动员及发挥修复作用的机制研究进展作全面概述。
心血管疾病（cardiovasculardisease，CVD）是我国居民疾病死亡首位原因，约40%[1]以上。心肌梗死（myocardialInfarction，MI）是心血管病中最危急重的病症之一,心肌梗死后心肌细胞数量的减少以及心脏瘢痕组织的增生使心脏收缩能力下降，最终导致心力衰竭。目前的治疗手段如溶栓、冠状动脉（冠脉）旁路移植术、介入治疗等都只能挽救濒临坏死的心肌，而对已坏死的心肌作用甚微。由于供体稀缺、免疫排斥等局限性，心脏移植（heartTransplantation，HT）无法成为临床常规治疗措施。利用干细胞进行心血管修复为临床治疗心肌梗死提供了新的思路，多种干细胞被证明在心肌梗死方面具有治疗潜能[2-3]。
造血干细胞（hematopoieticstemcells,HSCs）传统定义为多潜能性干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能，是所有血细胞和免疫细胞的始祖。早期对造血干细胞的研究主要集中在对于移植治疗血液病方面，目前这种方法广泛用于恶性、难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤的治疗。但最近研究发现造血干细胞除能够分化出所有种类的血细胞外还能分化为多种非造血谱系细胞如骨骼肌细胞[4]、肝脏细胞[5]、神经元[6]、心肌细胞[7]等。此外，造血干细胞获取相对容易，应用时无组织相容性及伦理争议，是极具潜力的治疗心肌梗死的“种子”细胞来源。
1心肌梗死后造血干细胞的动员机制
1.1趋化因子作用
心肌梗死（myocardialinfarction,MI）涉及心肌细胞坏死、炎症以及瘢痕形成，坏死过程伴随大量细胞因子等生物活性分子释放。造血干细胞归巢是一个复杂的过程，涉及造血干细胞动员、黏附、迁移及定植到缺血心肌部位。整个过程受各种细胞因子、骨髓微环境等相互作用的影响。趋化因子是一类具有化学引诱物作用的细胞因子，可被分为四个亚家族：CXC（或α-趋化因子），CC（或β-趋化因子），CX3C和XC，趋化因子家族与G蛋白偶联受体结合后具有介导趋化和细胞归巢的共性[7]。CCL2是CC亚家族的成员之一，主要与多种细胞表面表达的CCR2R结合。心肌梗死后血浆CCL2浓度升高，是充血性心力衰竭重要促炎因子，而心肌细胞内过表达CCL2则可以抑制其促炎作用且对心肌梗死后心肌细胞有保护作用[8]。CXCL2是CXC亚家族成员，与CCL2类似，CXCL2也同样具有双重作用，CXCL2和CCL2都被认为可以在缺血损伤早期募集中性粒细胞，但同时心肌细胞过表达后可以对心肌细胞有保护作用。因此未来的研究要注重如何在避免心肌损伤的情况下最有效地利用若干趋化因子的心肌保护作用。CXCL12是造血干细胞动员过程中重要的信号因子。骨髓中的CXCL12与CXCR4结合可以促使造血干细胞潴留在骨髓干细胞微环境中，骨髓CXCL12的浓度的降低可促使造血干细胞被趋化至外周血。而心肌梗死后局部CXCL12的分泌增加同样会促使骨髓造血干细胞动员至外周血中[9]。
动物模型表示CXCL12可以增强心肌梗死小鼠心室功能、改善心肌梗死区域周边毛细血管密度[10]。另外有报道称CXCR4的拮抗剂如AMD能够在缺血再灌注损伤后改善心功能恢复，根据动物实验结果，AMD可以通过破坏骨髓中的CXCL12与CXCR4的结合来促使实验动物缺血再灌注损伤后第1天增加CXCR4阳性细胞的动员[11]。而G-CSF、AMD等可以上调骨髓细胞中的几种蛋白水解酶如基质金属蛋白酶（matrixmetalloprotein,MMP）-2、MMP-9、组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶等，它们可以水解切割灭活SDF-1和CXCR4，来解除其“锚定”的作用。另外AMD可能通过增加动员至外周的骨髓干细胞中的内皮细胞一氧化碳合酶（eNOS）的合成来实现心功能的保护作用。eNOS是内皮细胞生长和迁移，血管重塑和血管生成的重要因子[12]，在缺血早期，eNOS的表达增加可以一定程度促进血管生成而增加毛细血管密度、抑制心肌凋亡。
1.2其他细胞因子作用
除了CXCL12和CXCR4相互作用以外，还有其他细胞因子及相关的信号通路作用于整个造血干细胞动员、归巢至心脏的过程[13-14]。如Wnt信号通路，Assmus等[15]表示心肌梗死诱导了典型Wnt信号的激活，与HSCs的扩展和迁移有关。Wnt通路是复杂的信号蛋白家族，经典和非经典的启动途径受组织微环境中的大量细胞因子和小分子的影响。非经典Wnt途径的激活可以在经典信号中发挥抑制作用。急性心肌梗死后骨髓内Wnt信号传导的机制尚不清楚，有学者推测是由于儿茶酚胺的激活导致的[15]。
此外，生物活性脂质鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）和神经酰胺-1-磷酸（ceramide-1-phosphate，C1P），已在外周血中被鉴定为主要的HSC化学引诱物[16-17]，其中S1P主要通过红细胞在外周血中转运，缺血性心肌损伤后先天性免疫系统的激活和全身补体的激活可以促使红细胞释放生物活性脂类物质，血浆C1P的主要来源是细胞内C1P释放或从受损细胞中泄漏[18]。到目前为止，研究人员已经鉴定出了S1P（S1P1-5）的五种受体亚型，S1P1-3在整个心血管系统和骨髓前体细胞中高度表达。S1P1作用由Gi蛋白、Ras-MAP激酶、PI3K-AKt、PLC途径介导。而S1P2和S1P3受体作用由PLC途径和Rho途径通过多种G蛋白介导。S1P与S1P1或S1P3结合来介导造血前体细胞的迁移。相反，激活S1P2则产生负调节HSPC动员的作用。S1P4和S1P5受体分别在免疫和神经系统中起作用。C1P同样可以与多种G蛋白偶联受体相互作用[18]。心脏神经生长因子（NGF）过表达能够促进骨髓来源前体细胞动员至心脏[19]。溶血磷脂酸（lysophosphatidicacid,LPA）处理过的脐带血来源CD34+细胞可以增强其在缺氧条件下的生存能力[20]，LPA主要通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）诱导CD34+细胞存活，PPAR-γ的激活可诱导Akt和ERK信号传导途径的激活和抑制线粒体凋亡途径（降低BAX和CASP9的表达）。
1.3心肌损伤是造血干细胞动员的重要前提
人体内大多数造血干细胞处于静止状态，可以在诸如感染等系统性损伤的情况下激活。HSC对组织损伤的反应可能与缺血性损伤中患者的长期存活率相关，且HSC在组织修复和患者康复中起一定作用[21-24]。有研究显示，急性心肌梗死后CD34+、CD+细胞水平显著增加，在缺血性损伤后7d达到顶峰，CD34+细胞的初始动员程度已被证明是急性心肌梗死后更有利于心肌重塑的独立预测因子。此外，急性心肌梗死后升高的多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）或粒细胞集落刺激因子（G-CSF），可调节造血祖细胞（hematopoieticprogenitorcells，HPC）的增殖[25]。Theiss等[26]测量了缺血性心肌病（ICM），扩张型心肌病（DCM）和正常人的心肌中归巢因子的mRNA表达水平，与扩张型心肌病和对照心脏相比，缺血性心肌病心脏中CXCL12，肝细胞生长因子，缺氧诱导因子-1a和血管细胞粘附分子显着升高（扩张型心肌病和对照心脏显示相似的表达）。心肌缺血后，各种趋化因子表达增加，可以进一步促进从骨髓中动员出的干细胞归巢心脏。心肌损伤后膜联蛋白-A1（ANX-A1）的表达也会增加，膜联蛋白-A1（ANX-A1）是一种糖皮质激素调节蛋白5，具有抗炎作用，可以保护心肌免受缺血性损伤、减少梗死面积，动物实验研究发现膜联蛋白-A1的缺乏会增加心肌缺血后小鼠梗死面积增加，心肌炎症反应增强，与之伴随的是造血干细胞的动员增加[27]。
此外，miRNA是最近研究的热点，部分miRNA具有组织特异性表达的特点，如心肌组织中富含miR-a和miR--5p，而miR-1a和miR-a则在心肌和骨骼肌中均存在高表达。有研究证明，心肌梗死后外周血内心肌特异性miRNA（miR-1,,and）会显著增高，这些外周循环内的心肌特异性miRNA大多存在于外泌体内被释放入血[28]。这些包裹心肌特异性miRNA的外泌体选择性地迁移至其他组织，且优先转移到骨髓，在骨髓中它们抑制CXCR4的表达并介导骨髓细胞的动员。
2造血干细胞应用于心肌梗死的机制研究进展近些年相继有临床实验使用造血干细胞用于治疗心肌梗死[29-31]。由此引出对造血干细胞对应用于心肌梗死的机制探讨。
2.1转分化机制
有学者认为造血干细胞动员至心脏后可以转化为心肌细胞。骨髓来源干细胞转化为心肌细胞是心肌细胞再生研究的重要方向，应用于心肌细胞转化研究的骨髓来源细胞主要包括两大类：即HSCs和间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC），有研究[32-34]证明，HSCs和MSCs都能获得心肌细胞表型，其中Fukata等[34]的研究检测了骨髓细胞在同基因骨髓移植后的心肌形成潜力，以鉴定具有心肌潜能的骨髓来源细胞群，骨髓来源的心肌细胞来源于造血谱系，而其中髓系细胞则是产生心肌细胞的主要中间体。年Orlic等将骨髓提取的骨髓单个核细胞注射到结扎了冠状动脉前降支的小鼠心肌梗死心肌区域内，发现9d后其心肌梗死区域心肌收缩功能改善，因此认为是移植的干细胞转化成了心肌细胞，而对于HSCs[14]获得心肌细胞表型的机制，上述研究尚无定论。因此对于对移植造血干细胞能否转化心肌细胞的问题上，应该保持谨慎态度。
2.2细胞融合机制
部分学者认为HSC动员至心脏后发挥作用的主要机制是产生了细胞融合的现象。年Balsal等[35]表明在表达绿色荧光蛋白（greenflfluorescentprotein，GFP）的转基因鼠的心肌梗死部位直接注射Ckit+骨髓细胞后并没有观察到Orlic所提到的转分化现象，虽然移植后10d可以在心肌中观察到大量GFP+细胞，但在30d后只有少量的GFP+细胞仍然存留在心肌。而且GFP+细胞没有表达特异心脏标记物，而表达CD45、髓系标志物Gr-1、淋巴系标志物B等造血系统标志物。之后Wu[36]等的研究提出Balsam等的数据一定程度低估了心肌受损后循环细胞的作用，因为其并没有考虑到心肌梗死后建立稳定的共生模型所需时间的因素。若交叉循环建立的稳定少于7d，那么在心肌梗死小鼠的心脏处骨髓来源细胞的聚集就不够充分，下一步的转化过程就无法顺利进行。考虑到损伤诱导信号是干细胞活动的重要调节因子，只有在损伤早期才会短暂升高，如免疫调节剂和趋化因子，Wu的研究较前者不同之处在于小鼠共生模型交叉循环稳定后（大约7～10d）再进行手术诱导心肌梗死（MI），从而重新评估循环细胞的作用。两周后进行分析发现少部分GFP+细胞分别表达内皮细胞和平滑肌细胞标志物：异凝集素（isolectin）和SM22α，表明循环细胞参与了微血管的重建。大部分不表达平滑肌细胞标志物的循环细胞大都表达造血细胞标志物CD45，包括T系（21.25±0.05%），B系（39.25±2.35%），巨噬细胞系（29.9±1.90%）。此外将MerCreMer（MCM）转染小鼠与GFP转染小鼠做同样处理并在心肌梗死部位取样做免疫组化分析发现GFP+细胞分散在缺血区域，部分细胞表达了成熟心肌细胞标志物肌钙蛋白T（CardiactroponinT，cTnT）。定量分析显示缺血区域GFP阳性细胞中有9.39%的细胞同时表达Cre(GFP+/Cre+)，表明循环GFP+细胞与原有心肌细胞发生了融合。同时（GFP+/Cre–）类型细胞占0.17%，提示循环细胞发生了转分化但比例较低。上述结果表明细胞融合相对转分化是较为主要的机制。心肌细胞是终末分化的细胞，具有非常有限的增殖能力。细胞融合可以促进心肌细胞重新进入细胞周期[37]，因此，细胞融合在心肌细胞修复中具有潜在的优势。
2.3旁分泌机制
对于转分化和细胞融合发挥的作用，越来越多人保持怀疑态度，因为大量进入心脏的细胞并不能长期存留。目前学者开始