Myocardialinfarctionacceleratesbreastcancer
viainnateimmunereprogramming
心肌梗死通过固有免疫的重新编程促进乳腺癌进展
疾病：心肌梗死对乳腺癌的影响
表型：
肿瘤增长（体积/重量）；细胞增殖；T细胞亚群变化；模型:
动物模型：
MMTV-PyMT转基因小鼠肿瘤细胞（E）原位植入乳腺脂肪垫的小鼠结扎LAD心肌梗死小鼠假手术组细胞模型：
E细胞/小鼠髓样乳腺癌细胞系
研究方法：
肿瘤组织的体积/重量超声Ki-67检测过继转移实验流式细胞术Nanostringanalysis免疫基因集分析RNA测序变量：CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chi单核细胞
结合临床：
回顾性分析2个乳腺癌前瞻性研究数据，发现与确诊乳腺癌后无心血管事件的患者相比，确诊后发生心血管事件的患者，乳腺癌的复发风险增加59%，乳腺癌的死亡风险增加60%。
科学假设：
心肌梗死会导致免疫细胞表型变化，诱导免疫细胞转化为免疫抑制表型，引发全身性免疫稳态失衡，促进乳腺癌的生长和转移
结果
手术诱导的心肌梗死加速了乳腺癌同系小鼠模型的肿瘤生长
a.E癌细胞原位植入C57BL/6J小鼠乳腺脂肪垫后3d行冠状动脉结扎或假手术，20d后随访肿瘤生长情况。
b.肿瘤植入后20天，MI组肿瘤体积明显大于假手术组(n=15MI,11假手术组)；
c.处死后，肿瘤体积和体重的定量分析，MI加速了肿瘤的增长，手术后20天，相比无MI组，MI组小鼠肿瘤的重量和体积增加2倍；
d.Ki67染色证实肿瘤边界细胞增殖情况，右侧为Ki67+细胞的定量图像。心肌梗死小鼠肿瘤边界的Ki67+细胞比假手术小鼠增加了一倍；在肿瘤的非免疫(CD45-)和免疫(CD45+)细胞组中细胞增殖均增加；
e.第20天，流式细胞术分析肿瘤免疫细胞(CD45+)以确定髓系亚群(n=14MI,11sham):
与假小鼠相比，MI中CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chi单核细胞的百分比增加(右)。
在CD45+细胞中，我们观察到CD11b（+）Ly6G（-）Ly6Chi单核细胞在小鼠肿瘤中的比例增加；而CD11b+Gr1?和CD11b+Gr1?F4/80+巨噬细胞、CD11b+Gr1?CD11c+树突状细胞、CD11b+Ly6G+Ly6Clo中性粒细胞没有差异。
由于CD11b+Ly6G?Ly6Chi单核细胞与单核骨髓源性抑制细胞(mMDSCs)具有类似的细胞表面标记物，可以限制T细胞浸润和抗肿瘤免疫反应，我们接下来测量了肿瘤内T细胞水平:
f.第20天，流式细胞术分析肿瘤免疫细胞(CD45+)以识别淋巴细胞亚群(n=11MI,10sham):CD3+T细胞;CD8+细胞*性T细胞;CD4+辅助T细胞;CD4+FoxP3+Treg细胞。
在CD45+细胞中，MI小鼠肿瘤中T淋巴细胞(CD3+细胞)较少，其中免疫抑制性的CD4+FoxP3+T调节(Treg)细胞比例高于sham；
g.通过对肿瘤组织RNA的免疫谱分析，证实了心肌梗死后促瘤Treg细胞的富集；
结论：
MI存进了乳腺癌的生长，促进乳腺癌细胞的增殖，并且在肿瘤内的CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chi单核骨髓来源的抑制细胞比例增加，肿瘤内的淋巴细胞的亚群发生改变，具有免疫抑制性的Treg细胞的比例增加，说明MI诱导的肿瘤生长可能与改变肿瘤内免疫细胞种群有关。
心肌梗死对造血系统的影响是否与肿瘤中免疫细胞组成的改变有关
1.暴露于心肌梗死的非肿瘤小鼠与假小鼠相比，循环单核细胞增加，术后约12天开始减少；
2.相比之下，在E乳腺癌模型的小鼠中，MI诱导了循环中Ly6Chi单核细胞的持续增加；流式细胞术对骨髓造血干细胞和祖细胞群的分析显示，与假手术相比，MI后9d常见的髓系祖细胞(Ly6Chi单核细胞的前体)数量增加；
为了研究MI是否增加了Ly6Chi单核细胞向肿瘤的募集
3.使用同源CD45.1和CD45.2小鼠进行了过继转移实验，在MI后或假手术后9天，从CD45.1非肿瘤的小鼠中分离Ly6Chi单核细胞，转移到E乳腺癌模型的CD45.2小鼠，12天时，MI后或假手术后CD45.1单核细胞向肿瘤的募集没有观察到统计学差异。CD45.1非肿瘤的小鼠中分离Ly6Chi单核细胞，转移到MI后或假手术后9天的E乳腺癌模型的CD45.2小鼠中，MI增加了招募。尽管两种情况下肿瘤体积相当，但CD45.1Ly6Chi单核细胞进入肿瘤。
4.肿瘤转录组分析显示，相比假手术，暴露于心肌梗死小鼠肿瘤的趋化因子基因表达增加，包括Cxcl13（与乳腺癌进展相关），受体Cxcr5在暴露于心肌梗死的乳腺癌模型小鼠的单核细胞中增加，且与肿瘤进展和转移相关的趋化因子受体Cxcr1在暴露于心肌梗死的乳腺癌模型小鼠的单核细胞中表达增加。CXCL13-CXCR5轴的上调可能是Ly6Chi单核细胞向肿瘤募集增加的基础。
Ly6Chi单核细胞的可用性和募集的增加是否促进MI诱导的肿瘤生长
MI后或假手术后7天的乳腺癌模型小鼠，通过使用表达白喉*素(DT)受体的小鼠(DTR)，控制CCR2位点，从而敲除CCR2+Ly6Chi巨噬细胞。通过连续的DT注射减少血液(90%)和骨髓(~55%)中CCR2+Ly6Chi巨噬细胞。（CCL2/CCR2可以促进单核巨噬细胞的聚集）
5.心肌梗死小鼠的肿瘤生长抑制达56%；假手术暴露的CCR2-DTR小鼠的单核细胞消耗没有显著减少肿瘤生长。尽管暴露于心肌梗死和假手术的CCR2-DTR小鼠的瘤内Ly6Chi单核细胞等效消耗。在心肌梗死或假手术后7天使用CCR2抑制剂的C57BL/6小鼠中也发现了类似的MI加速肿瘤生长的抑制作用。
T细胞种群比例的改变
6.在MI后的乳腺癌小鼠中，流式细胞术分析肿瘤内的T细胞种群显示，CCR2+细胞敲除减少了免疫抑制性CD4+FOXP3+Treg细胞的比例，增加了CD8+细胞*性T细胞。
MI诱导的肿瘤生长需要CCR2（+）的Ly6Chi巨噬细胞，这类细胞的招募限制了抗肿瘤适应性免疫反应。
进一步了解髓系细胞促进乳腺癌生长的功能机制，从心肌梗死或假手术后的E肿瘤中分离单核细胞，并测试其改变CD8+T细胞增殖和激活的能力。
7.与心肌梗死或假手术小鼠分离的单核细胞共培养后的CD8+T细胞增殖没有观察到差异；但是心肌梗死后的小鼠更有效的抑制CD8+T细胞的活化，通过测量IFN-γ、TNF-α、GranzymeB的表达。
总结，这些数据表明:
(1)这些瘤内髓系细胞符合mdscs的功能标准;
(2)在单个细胞的基础上，来自MI处理小鼠的mMDSCs比其假对照具有更强的免疫抑制能力;
肿瘤Ly6C+mMDSCs表现出MI诱导的免疫抑制转录表型，该表型在骨髓中表现为表观遗传印迹
单核细胞骨髓来源的抑制细胞基因表达的差异
1.术后17天肿瘤中mMDSCs的RNA测序(RNA-seq)：MI小鼠与假手术小鼠相比，有个基因表达差异，已知限制癌症发病机制的基因通路在心肌梗死小鼠的mMDSCs中显著下调；
2.分子功能本体(MolecularFunctionalOntology)和REACTOME通路(REACTOMEPathway)分析：
与假手术相比，MI小鼠的mMDSCs在免疫应答、淋巴细胞活化、适应性免疫系统功能和IFN-γ信号通路的调节过程下调；
MI后mMDSCs中表达下调的基因与主要组织相容性复合体II类(MHCII)呈现相关的基因（Cd74和h2特异性基因）和T细胞活化相关的基因（Cd40和Irf4）；
通过对差异表达基因上游调控因子的分析，可以预测炎症介质如IFN-??和(STAT1)的抑制，以及抗炎调节因子如白细胞介素(IL)-10受体的激活(IL10RA)；
MI或假手术后7天，用抗cd8或对照IgG治疗E荷瘤小鼠，并测量其对肿瘤生长的影响
3.假手术小鼠组，CD8+T细胞敲除使肿瘤生长速度高于对照组IgG；相比之下，在MI小鼠中，CD8+T细胞敲除对肿瘤生长无统计学差异。（在MI中CD8+T细胞功能已经抑制有关）结果表明MI加速肿瘤生长的作用部分是由于CD8+功能失调所致T细胞的反应。
调查MI是否在肿瘤募集前对Ly6Chi单核细胞库进行了重组，我们在观察到肿瘤大小差异前的肿瘤生长早期分离血液中的CD11b+Ly6Chi单核细胞，进行了RNA测序(MI后9天)。
使用基因集一致性分析，我们检测肿瘤中CD11b+Ly6ChimMDSCs中差异表达的基因是否在mi后循环CD11b+Ly6Chi单核细胞中富集。
4.与背景基因表达相比，肿瘤CD11b+Ly6ChimMDSCs中前个差异表达的基因(个上调，个下调)在MI的循环CD11b+Ly6Chi单核细胞中显著表达；在MI后17d从骨髓中分离的CD11b+Ly6Chi单核细胞中，该基因组也显著高表达和低表达，表明MI诱导了髓细胞库的持续重编程。
最近的研究已经证实，微生物和无菌的炎症可以触发整个基因组的表观遗传的变化改变先天免疫记忆印记，我们下一步研究MI是否改变了肿瘤小鼠骨髓Ly6Chi单核细胞的染色质景观，使用基于转座酶和高通量测序的染色质分析技术(ATAC-seq)。
5.与假手术相比，暴露于MI的小鼠骨髓Ly6Chi单核细胞的染色质分布有明显变化，其中个区域的染色质更易接近，个区域的染色质可接近性降低；
6.基因组区域富集注释工具(GREAT)分析表明，MI后可及性增加的区域富集了与应激反应相关的通路，包括内质网应激、应激的转录反应和未折叠蛋白的反应；
7.对MI后显示可及性降低的区域的分析显示，调节免疫和炎症反应的通路丰富，如细胞因子的产生，淋巴细胞活化的调节和对伤害的反应；
8.MI后染色质区域内不易接近的转录因子结合基序分析，识别了先驱因子pu1和ccaat增强子结合蛋白(CEBP)以及IFN调节因子(IRF)-8的结合位点，它们与pu1在单核细胞增强子上协同结合激活炎症反应。值得注意的是，IRF-8水平的降低损害了髓系细胞的分化，导致单核细胞表型与免疫抑制mMDSCs相似。
为了检测骨髓单核细胞染色质的改变是否反映在MI后肿瘤mMDSCs的转录变化中，我们整合了骨髓Ly6Chi单核细胞ATAC-seq和肿瘤Ly6Chi单核细胞RNA-seq数据集。
9.该分析确定了许多受pu1调控的基因，CEBP和IRF-8在肿瘤mMDSCs中均被转录抑制，在骨髓单核细胞中显示染色质可及性降低；这些包括参与T细胞激活的Cd40和Cd86基因，与训练免疫有关的Clec7a(Dectin-1)，以及Irf8（训练免疫是一种新兴的概念，它定义了先天免疫系统形成免疫记忆并对外来入侵提供长期保护的能力。）
综上所述，这些数据表明MI通过表观遗传学重组骨髓单核细胞，使其具有持续存在于肿瘤mMDSCs中的免疫抑制表型。
由于骨髓祖细胞的表观遗传学改变已被证明是先天免疫记忆的基础，我们接下来用骨髓移植的方法测试了在癌症背景下，MI是否诱导了造血祖细胞的长期习得反应。
10.骨髓移植后14周的外周血分析：与CD45.2小鼠的肿瘤小鼠在假手术20天分离的骨髓相比，CD45.2的肿瘤小鼠在MI后20天分离的骨髓，对CD45.1的小鼠进行骨髓重组，结果显示循环单核细胞水平升高；
11.CD45.1受体小鼠的乳腺脂肪垫中植入E肿瘤细胞后，我们观察到心肌梗死小鼠的骨髓重组后，肿瘤生长加速；
这些数据表明，心肌梗死后骨髓印迹的表观遗传变化在移植到原始小鼠后持续存在，在原始小鼠中，它们驱动骨髓生成并加速肿瘤生长。
心肌梗死加速了小鼠的癌症进展，心血管事件的发生增加了早期乳腺癌患者复发和癌症特异性死亡率的风险
在自发性乳腺癌(MMTV-PyMT)转基因小鼠模型中测试了MI的作用，该模型也作为肺转移发病机制研究
我们在可触摸到的乳腺肿瘤形成(累积肿瘤负荷＜mm3)开始时进行心肌梗死或假手术和监测肿瘤生长超过18天。
1.与我们在E肿瘤模型中发现的结果一致，在MMTV-PyMT小鼠中，MI明显加速了肿瘤的生长，与假手术相比。肿瘤生长加速与循环单核细胞水平的升高相似(扩展数据)图10)，尽管这没有达到统计学意义
在MMTV-PyMT模型中，浸润的Ly6Chi单核细胞分化为MHCIIhiCD11blo免疫抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，这是这些肿瘤中主要的髓系细胞类型。
2.与此相一致的是，我们在MI暴露小鼠肿瘤中观察到Ly6Chi单核细胞来源的TAMs的增加，但在mMDSC中没有差异，与sham暴露小鼠相比
3.我们还观察到肿瘤内免疫抑制Treg细胞(FoxP3+)的比例增加，进一步表明MI与肿瘤免疫抑制相关
研究MI是否改变了MMTV-PyMT小鼠的转移负荷，我们在原发肿瘤体积相似的小鼠中进行了亚组分析
4.我们发现，通过肺内Pymt的表达(图4d)和Ly6Chi单核细胞的肺聚集(图4e)评估，MI增加了转移负担，这对(前)转移位的形成至关重要
对两项早期乳腺癌前瞻性病例队列研究进行了回顾性分析
结合临床，我们对两项早期乳腺癌前瞻性病例队列研究进行了回顾性分析，评估新发、诊断后心血管事件(如心肌梗死或中风)与癌症结局(复发和癌症特异性死亡)之间的关系。排除患有心血管疾病或在癌症诊断时存在心血管危险因素的患者，其余患者(n=)进行多重协变量校正。
从诊断开始平均随访时间为11.7年，我们发现，与无心血管事件的人群相比，诊断后的心血管事件与调整后的复发风险增加相关(59%(95%置信区间(CI)，1.23-2.06)和乳腺癌特异性死亡率增加相关（60%(95%CI,1.16-2.22)）。
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