彭洋讲白癜风 http://m.39.net/pf/a_9192418.html原代心肌细胞的提取过程其实并不是很复杂。但是为了提取过程的顺利进行，前期准备工作确实相当的繁琐。甚至部分课题组在本校或本单位不能购置到相应的乳鼠，需要长途跋涉，从其他地方运输过来。本节教程将主要介绍原代心肌提取的前期准备工作。下一节内容，正式进入提取过程。一、实验背景知识心肌细胞（包括H9c2细胞，或原代心肌细胞）是心血管疾病相关研究的常用模型细胞。相比于H9c2，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近机体实际情况。因此，原代心肌细胞的提取，直接关系相关实验的进程及结果。关于细胞来源，一般来讲，选用新生1~3天的SD大鼠。通常，鼠龄越小，越利于原代细胞的提取，其心肌细胞分离后成活率越高。除了自行提取心肌细胞之外，部分厂家亦有提供原代心肌细胞。在他们的宣传中有提到这么个说法——新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。这句话的出处和可信度有待进一步考究，朋友们也可以在文末留言小程序中告诉小编。关于消化酶的选择，小编主要选用了细胞培养常用的0.25%胰酶和II型胶原酶。其中，胰酶的消化作用较强，容易造成心肌细胞损伤，需要严格控制使用时长。II型胶原酶的作用较为缓和，能够消化细胞间质中的胶原并释放细胞。另外，关于I型胶原酶和II型胶原酶的区别。胶原酶I常用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。胶原酶II常适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。二、实验准备阶段原代提取实验的前一日：首先，我们需要准备两瓶或足量无水乙醇，-20℃预冷。取一瓶或足量D-Hanks，4℃预冷。之后，按照购买的II型胶原酶的说明书要求，提前配制好胶原酶储备液。或是提前将已经配制好的保存于-20℃的储备液于4℃化开。如下图所示，小编使用的是索莱宝的产品，按照说明书推荐，使用无血清的培养基，将粉末配制为2mg/ml的储备液，0.22μm孔径的针筒滤器过滤，注意过滤过程的无菌操作。配制完成后，分装冻存。最后，我们还需要提前准备好相关的手术器械、一个小锥形瓶（或任何方便操作的小瓶子）、锡箔纸、磁力转子、无菌包布。将所有准备好的物品打包，高压灭菌。强调一下，无菌包布是用于提取过程中给操作台铺巾用的，因此在拆包的过程中，一定要严格区分有菌面和无菌面。关于这个无菌操作，我们的外科的小伙伴们一定非常熟悉了。再强调一下，小瓶子、磁力转子以及锡箔纸是要提前组装好，如下图，作为一个整体进行高压灭菌。此外，锡箔纸需要稍微多备几块，同步高压灭菌。以免在后续实验过程中，拆开小瓶子瓶口的时候意外损伤封口的锡箔纸，且临时没有其他替补封口。嗯，这句话说的好拗口，大概就是，盖子破了回头有的换，这个意思。原代提取的当日：提前超声清洗两个1L的大烧杯，放入传递窗紫外灭菌，以供大鼠表皮消*时使用。准备两套无菌手套，提前移入细胞间。一套手套用于组织分离的过程，另一套用于细胞分离的过程。酒精棉球彻底擦拭磁力搅拌机表面，稍晾干，置入传递窗紫外灭菌，灭菌完成后移入细胞间备用。注意，酒精棉球擦拭时，磁力搅拌机一定一定一定要拔插头断电！！！使用的酒精棉球不宜过湿！！！一定一定一定待完全晾干后，再通电！！！取10~20只1~3天的新生SD大鼠。取大鼠的路上，一定要注意保暖和透气，尤其是寒冬或者是炎夏。大鼠一旦死亡，心肌组织活力迅速下降，心肌细胞提取亦会大概率失败。准备一箱碎冰。准备细胞培养的全套液体，包括血清、胰酶、高糖DMEM、预冷的D-Hanks。嗯，当然要提前紫外灭菌30min。详情参见小编之前的文章《生物小白的入门必修课——细胞培养》。之后，进入细胞间，提前配制含有20%血清的完全培养基，插入碎冰中预冷。每20只大鼠，相应配制25ml完全培养基。使用先前准备好的胶原酶储备液，配制成0.08%的II型胶原酶，置于37℃细胞培养箱中预热。再强调一次，完全培养基是预冷，胶原酶是预热，别弄混啦。三、实验准备阶段的关键词总结无水乙醇-20℃预冷；D-Hanks4℃预冷；配制二型胶原酶储备液与工作液；手术器械高压灭菌；磁力搅拌机；一箱碎冰；1~3天的SD大鼠。至此，繁琐的准备工作终于结束了。万里长征，我们迈出了第一步。下一节，我们将正式进入原代提取的步骤。结束分割线利益声明：本教程未涉及任何商业推广，所用试剂、耗材可根据各课题组需求酌情更换。
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